Marine Culture Media Preparation and glyTE Cryopreservation of Bioreactor Samples for Flow Cytometry (En Español)

ecastron@utalca.cl (Eduardo Castro) — Sat, 07 Nov 2026 00:00:00 +0000

Adaptado del protocolo compartido por Sara Cuadros y del protocolo de criopreservación con glyTE del Bigelow Single Cell Genomics Center (Stepanauskas, 2016).

Contexto

En citometría de flujo, las partículas presentes en el medio de cultivo (restos de peptona o extracto de levadura, sales no disueltas, precipitados) generan eventos que se superponen con las bacterias en los gráficos de dispersión y fluorescencia. Filtrar el medio por 0,22 µm antes de usarlo reduce este ruido de fondo y mejora tanto la cuantificación como el rendimiento del sorting, cuando corresponde.

Las muestras se criopreservan sin fijador, con glyTE (glicerol + TE) como crioprotector. Este es el método recomendado por el Bigelow Single Cell Genomics Center, que pide evitar sustancias que comprometan la calidad del ADN o la integridad celular, como los aldehídos [Bigelow SCGC]. En genómica de células individuales, el paraformaldehído deja las células inservibles para secuenciación y el etanol reduce la calidad de los genomas recuperados, en comparación con la criopreservación con glicerol [Clingenpeel et al., 2014].

1. Preparación del medio de cultivo

1.1 Materiales

Medio de cultivo marino (por ejemplo, Marine Broth 2216 o medio a base de agua de mar)
Agua destilada o Milli-Q
Botellas de vidrio autoclavables (tipo Schott)
Agitador magnético con calefacción (para hervir el Marine Broth 2216)
Opción A: sistemas de filtración al vacío de 0,22 µm (embudo + botella receptora, membrana PES) y bomba de vacío
Opción B: bomba peristáltica, manguera de silicona y filtros Sterivex de 0,22 µm
Autoclave
Gabinete de bioseguridad
Sistemas de filtración al vacío estériles de un solo uso de 0,22 µm (para la filtración posterior al autoclavado)

1.2 Procedimiento

Preparar el medio según las indicaciones del fabricante. En el caso de Marine Broth 2216, suspender 37,4 g de polvo en 1 L de agua y calentar con agitación frecuente hasta hervir durante 1 minuto, para disolver completamente el polvo.

Dejar enfriar el medio y filtrarlo por 0,22 µm antes de autoclavar, usando una de estas dos opciones:

Opción A, vacío: verter el medio en el embudo del sistema de filtración y aplicar vacío. Cambiar la unidad si el flujo disminuye notoriamente.
Opción B, bomba peristáltica: conectar la manguera de la bomba a la entrada del filtro Sterivex y recoger el filtrado en una botella limpia. Mantener un flujo moderado y cambiar el Sterivex cuando el flujo baje o aumente la presión en la manguera, ya que la peptona y el extracto de levadura pueden colmatar el filtro.

Autoclavar el medio filtrado a 121 °C durante 15 minutos.

Importante: los medios marinos precipitan durante el autoclavado. Las sales del medio (principalmente de calcio y magnesio) pueden precipitar con el calor. El propio fabricante indica que Marine Broth 2216 preparado presenta precipitado, y DSMZ recomienda retirar por filtración, si es necesario, el precipitado que se forma tras autoclavar. La filtración previa no elimina este precipitado, y las partículas demasiado pequeñas para verse igual generan eventos en el citómetro. Por eso se filtra nuevamente después de autoclavar (paso siguiente).

Dejar enfriar el medio autoclavado a temperatura ambiente. En el gabinete de bioseguridad, filtrarlo por 0,22 µm usando un sistema de filtración al vacío estéril de un solo uso, que recoge el medio directamente en su botella receptora estéril. Alternativamente, usar la bomba peristáltica con un filtro Sterivex nuevo (los Sterivex vienen estériles) y manguera autoclavada, recogiendo el filtrado en una botella autoclavada. Tapar la botella dentro del gabinete.

Reservar una alícuota del medio final (filtrado y autoclavado, sin inocular) como blanco de medio. Este blanco se criopreserva igual que las muestras (Sección 2) y permite estimar el ruido de fondo del medio en el citómetro.

2. Toma de muestras y criopreservación

2.1 Materiales

Criotubos estériles (al menos 3 por muestra o punto de muestreo)
Etiquetas resistentes a la congelación y marcador permanente
Micropipetas (P1000 y P200) y puntas estériles
Stock de glyTE (Sección 3)
Nitrógeno líquido o hielo seco
Ultracongelador a −80 °C

2.2 Procedimiento

Etiquetar los criotubos con anticipación. Si se usan etiquetas impresas o cinta, pegarlas 24 horas antes y comprobar que estén bien adheridas antes de llenar los criotubos, para evitar que se despeguen durante la congelación. Preparar al menos 3 réplicas por muestra.

Tomar la muestra del biorreactor en condiciones asépticas y procesarla lo antes posible, ya que una manipulación rápida reduce el riesgo de degradación del ADN.

Transferir 1 mL de muestra (bacterias en el medio de cultivo) a cada criotubo.

Agregar 100 µL de stock de glyTE a cada criotubo.

Mezclar con mucha suavidad, invirtiendo el tubo unas pocas veces o con un pipeteo muy suave.

No usar vórtex en este paso. Bigelow indica mezclar suavemente.

Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 1 minuto, para que el glicerol se distribuya en la muestra antes de congelar.

Congelar rápidamente, sumergiendo los criotubos en nitrógeno líquido o colocándolos sobre hielo seco. Luego, almacenarlos a −80 °C hasta el día del análisis.

Cuantificación. Las muestras con glyTE no están fijadas. Bigelow indica que pueden usarse para análisis que no dependen de la viabilidad celular, como la tinción con SYTO-9 u otro colorante de ADN. Al calcular la abundancia, multiplicar los conteos por 1,1 (1.100 µL / 1.000 µL) para corregir la dilución con glyTE y obtener células por mL del biorreactor.

Evitar cambios de salinidad. Las células no deben exponerse a cambios importantes de fuerza iónica durante el procesamiento. Si es necesario diluir una muestra, usar medio de cultivo o agua de mar filtrada y estéril, nunca agua destilada.

Muestras hipersalinas. Este método no es aplicable a muestras hipersalinas, porque se forman cristales de sal durante la congelación. Además, para muestras con salinidad mayor que 35 PSU, Bigelow pide incluir entre 10 y 50 mL de muestra sin tratar, por si es necesario diluirla antes del sorting.

3. Preparación del stock de glyTE

3.1 Materiales

TE 100x pH 8,0 (1 M Tris-HCl, 100 mM EDTA)
Agua desionizada
Glicerol de grado molecular
Jeringa de 50 mL o más (para medir el glicerol)
Filtro de 0,2 µm (filtro de jeringa o sistema de filtración al vacío)
Tubos estériles para alicuotar

3.2 Procedimiento

Mezclar en un recipiente estéril:

20 mL de TE 100x pH 8,0
60 mL de agua desionizada
100 mL de glicerol de grado molecular (medirlo con jeringa, ya que es demasiado viscoso para medirlo con probeta)

Mezclar bien hasta homogeneizar y pasar el stock por un filtro de 0,2 µm.

Alicuotar y almacenar a −20 °C.

Concentraciones resultantes:

	Glicerol (v/v)	TE
Stock de glyTE (180 mL)	~55,6 %	~11x
Muestra con glyTE (1 mL + 100 µL)	~5 %	~1x (10 mM Tris, 1 mM EDTA)

Referencias

Clingenpeel S, Schwientek P, Hugenholtz P, Woyke T. 2014. Effects of sample treatments on genome recovery via single-cell genomics. The ISME Journal 8:2546-2549. doi:10.1038/ismej.2014.92
Stepanauskas R. 2016. Aquatic, sediment, soil and fecal sample cryopreservation for microbial single cell genomics, using glyTE. Bigelow Laboratory for Ocean Sciences, Single Cell Genomics Center. PDF
Bigelow Single Cell Genomics Center. Preparation & Shipment. scgc.bigelow.org
Stepanauskas R. 2022. Microbial probing with RedoxSensor Green for single cell genomics. Bigelow Laboratory for Ocean Sciences, Single Cell Genomics Center. PDF
BD. Difco & BBL Manual: Marine Agar 2216, Marine Broth 2216, pp. 351-352.
DSMZ. Medium J1244, Marine Broth 2216 with pyruvate. bacmedia.dsmz.de

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