DNA Extraction from Sterivex (0.22µm) or Polycarbonate Filter (3µm) (En Español)

ecastron@utalca.cl (Eduardo Castro) — Mon, 17 Jul 2023 00:00:00 +0000

Creado por el Laboratorio Castro.

1. Extracción de ADN

1.1 Materiales

Placa petri
Sonicador
Bisturí
Micropipeta (p1000, p200, p20)
Guantes
Buffer de lisis
Lisozima (100 mg/µl)
Tubo de molienda
Beads
Proteinasa K (200 mg/µl)
SDS 10%
Solución fenol-cloroformo-alcohol isoamílico
Isopropanol
Etanol 70%
Pinzas
Puntas micropipeta (p1000, p200, p20)
Tijeras de podar
Tubos (1.5 mL)
Tubos (2 mL)

1.2 Procedimiento

Retirar con pinzas estériles el filtro de policarbonato (3 µm) del tubo Falcon y depositarlo en una placa de Petri. Utilizando un bisturí y una punta de micropipeta P1000, cortar el filtro en pequeños trozos y transferirlos a un tubo de 2 mL con beads de borosilicato (Merck, Z273619-1EA). Por lo general, el filtro mantiene gotas residuales de filtración; transfiera todo el líquido al tubo con beads.

Para colapsar la cubierta externa del filtro Sterivex (0.22 µm), se deben utilizar tijeras de podar previamente esterilizadas con etanol al 70%, partiendo desde el extremo de salida del filtro. Depositar el filtro en una placa de Petri estéril y utilizar un bisturí y una punta de micropipeta P1000 para cortar el filtro en pequeños trozos. Transferir los trozos a un tubo con beads. Al igual que con el filtro de 3 µm, el filtro Sterivex suele presentar líquido residual; transferir todo el volumen al tubo con beads.

Considerar el uso de campana o mechero durante el procedimiento.

Añadir 750 µL de buffer de lisis y 60 µL de lisozima (100 µL/mL) (Thermo Fisher, 89833) al tubo con los beads. Agitar inmediatamente en el vórtex a máxima velocidad durante 10 minutos. Luego, incubar los tubos a 40 °C durante 1 hora en el termobloque, agitando moderadamente en el vórtex cada 30 minutos.

Retirar los tubos del termobloque, agregar 5 µL de proteinasa K (200 mg/mL) y 75 µL de SDS al 10%. Incubar nuevamente durante 1 hora a 55 °C, agitando con el vórtex suavemente cada 30 minutos.

Finalizada la incubación, centrifugar a 12.000 × g durante 5 minutos a 4 °C y transferir el sobrenadante completo a un tubo Eppendorf de 1.5 mL.

Agregar 500 µL de solución fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1), mezclar por inversión y centrifugar a 12.000 × g durante 5 minutos a 4 °C. Recuperar la fase acuosa superior y transferirla a un tubo Eppendorf de 1.5 mL.

Repetir la extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico. Agregar 500 µL de isopropanol frío (−20 °C) al tubo, mezclar por inversión e incubar toda la noche a −20 °C.

Centrifugar a 12.000 × g durante 25 minutos a 4 °C. Descartar cuidadosamente el sobrenadante y agregar 500 µL de etanol al 70%. Centrifugar a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C. Descartar el etanol sin remover el pellet. Repetir el lavado con 500 µL adicionales de etanol al 70%.

Eliminar todo el remanente de etanol secando el tubo en el termobloque a 40 °C durante 40 minutos.

Resuspender el pellet en 60 µL de agua libre de nucleasas y cuantificar.

1.3 Preparación del buffer de lisis

En un shot estéril, mezclar:

Xantogenato (Sigma 254770) — 1% p/v
Acetato de amonio — 4 M
Tris-HCl pH 7.4 — 10% v/v
EDTA disódico 0.45 M pH 8 — 3.6% v/v

Completar con agua libre de nucleasas hasta el volumen final deseado. El buffer puede guardarse cubierto con papel aluminio a 4 °C por hasta 7 días.

Sampling and Filtration of Water from Mesocosm Experiments (En Español)

ecastron@utalca.cl (Eduardo Castro) — Wed, 31 May 2023 00:00:00 +0000

Creado por el Laboratorio Castro.

1. Recolección de muestras de agua

1.1 Materiales

Generador Honda EU10i
Alargador
Electrobomba con rodete periférico
Malla de 50 µm (Sefar)
Manguera para bomba eléctrica (FLEXHOSE PVC FIBER REINFORCED 70 PS)
Cuerda (~60 m)
Bidones de 35 L
Sensor Hobo Onset Temp/Light
Amarracables (pequeños y medianos)
Guantes
Botellas J 125 mL
Multiparámetro (HANNA HI9829)
Caja con diversas herramientas
Jarro de 1 L
Paños de limpieza
Cinta americana (DuckTape)
Jeringa 50 mL

1.2 Procedimiento

El día anterior al muestreo, lavar todo el material (bidones y jarro) con agua corriente (1 vez), hipoclorito de sodio al 1% (1 vez) y agua miliQ (3 veces).

Previo a la extracción de agua, se deben amarrar los sensores Hobo a la electrobomba utilizando y ajustando los amarracables para evitar movimiento del sensor. Asegurarse de que la manguera esté bien apretada a la entrada de la bomba para evitar pérdidas o colapso de la manguera; en el extremo de salida se acopla la malla de 50 µm.

Sumergir la electrobomba en la columna de agua sin que esté encendida. Fijar con cuerdas si es necesario para evitar movimiento pendular. Antes de encender el generador Honda EU10i, asegurarse de que la palanca lateral se encuentre hacia atrás (mayor potencia), el botón trasero indique la figura del conejo, y la perilla esté en ON. Previo al llenado de bidones, esperar 1 minuto para ambientar la manguera con el agua del entorno. Como recomendación, el extremo de salida de la manguera puede fijarse con un nudo de anclaje hacia el arco de la plataforma.

Antes de comenzar a llenar los bidones, ambientar la manguera y los bidones 3 veces con el agua que se muestreará. Luego de extraer 35 L de agua, recolectar agua con el jarro de 1 L para medir parámetros fisicoquímicos con el multiparámetro (HANNA HI9829). Adicionalmente, recolectar agua en jeringas de 50 mL para ser utilizadas en el procedimiento de filtración de nutrientes inorgánicos (ver punto 2).

Una vez recolectada la muestra, apagar el generador y desmontar la electrobomba, evitando que bombee aire (lo que interferiría en su correcto funcionamiento).

Trasladar inmediatamente las muestras recolectadas a la cámara fría (4 °C) hasta el comienzo de la filtración.

Considerar el uso de indumentaria impermeable, dado que es imposible no terminar mojado.

2. Filtración de las muestras

2.1 Materiales

Bomba peristáltica MasterFlex
Manguera MasterFlex 06509-25 Tygon (transparente)
Manguera MasterFlex 6424-25 (blanca)
Cabezales y fierritos (×4)
DNA/RNA Shield
Tubos Falcon 15 mL
Tubos Falcon 50 mL
Filtros 0.22 µm (pirinolas)
Filtros GFF 25 mm
Filtros GFF 25 mm muflados
Filtros Sterivex PES (0.22 µm)
Filtros de membrana Isopore Type 3.0 µm
Parafilm
Micropipeta P1000
Caja de puntas P1000
Marcador permanente (×3)
Pinzas planas
Portafiltro Swinnex 25 mm
Portafiltro Swinnex 47 mm
Pipetas plásticas 20 mL
Amarracables
Cloro 1%
Etanol 70%
Agua miliQ

2.2 Filtración para determinación de clorofila y nutrientes orgánicos e inorgánicos

La filtración de clorofila y nutrientes orgánicos se realiza con los portafiltros Swinnex de 25 mm, considerando 1 L de muestra por filtración y dos líneas con portafiltros. Conectar la manguera MasterFlex 06509-25 Tygon (transparente) en la parte anterior del portafiltro (hacia la muestra) y la manguera MasterFlex 6424-25 (blanca) en la parte posterior. Luego de armar las líneas, asegurar las mangueras en la bomba peristáltica sin apretarlas en exceso. Colocar con pinzas un filtro GFF 25 mm para la línea de clorofila y un filtro GFF 25 mm muflado para la línea de nutrientes orgánicos. Al momento de filtrar, se recomienda aplicar 130 rpm si la muestra no presenta turbidez significativa; de lo contrario, reducir la velocidad hasta 60 rpm.

Al finalizar, doblar cada filtro hacia adentro en dos, envolver en papel aluminio y guardar en tubos de 15 o 50 mL a −20 °C hasta su procesamiento en el laboratorio. Lavar inmediatamente las mangueras y el portafiltro Swinnex de 25 mm con 1 L de agua potable, 1 L de cloro al 1% y 1 L de agua miliQ.

Para determinar la concentración de nutrientes inorgánicos, filtrar 100 mL de muestra utilizando una jeringa de 50 mL. Ambientar 3 veces la jeringa y las botellas J antes de comenzar. Acoplar el filtro de 0.22 µm (pirinola) y filtrar hasta completar 100 mL en las botellas J. Guardar las botellas J a −20 °C para análisis posterior.

2.3 Filtración para extracción de material genético

La filtración para extracción de material genético se realiza con los portafiltros Swinnex de 47 mm. Para aumentar el largo de la manguera de entrada (transparente), acoplar una pipeta de 10 mL que vaya directamente a la muestra. Colocar el filtro de membrana Isopore Type 3 µm en el portafiltro Swinnex de 47 mm. Para finalizar el ensamblaje de la línea, unir el filtro Sterivex 0.22 µm a la boca de la manguera de salida (blanca). Ajustar las conexiones de las mangueras hacia y desde los filtros con amarracables para evitar pérdida de volumen.

Para filtraciones con objetivo de extracción de ADN, no superar los 120 rpm; si la muestra presenta turbidez, reducir hasta 60 rpm.
Para filtraciones con objetivo de extracción de ARN, no superar los 80 rpm; reducir hasta 50 rpm si la muestra está turbia.

El volumen de filtración por muestra es de 5 a 10 L, o hasta la saturación del filtro Sterivex 0.22 µm. Monitorear continuamente las mangueras para evitar fugas.

Una vez filtrado el volumen o saturado el filtro Sterivex, detener la bomba peristáltica y desacoplar el portafiltro Swinnex de 47 mm para retirar el filtro de membrana de 3 µm. Doblarlo hacia adentro dos veces y guardarlo en un tubo Falcon de 15 mL:

Si se extraerá ARN: añadir 500 µL de DNA/RNA Shield al tubo.
Si se extraerá ADN: guardar el filtro sin añadir nada.

Desacoplar el filtro Sterivex de la manguera de salida y descartar el líquido interior sacudiéndolo suavemente. Sellar la salida con Parafilm:

Si se extraerá ARN: añadir 500 µL de DNA/RNA Shield y sellar la entrada con Parafilm.
Si se extraerá ADN: sellar la entrada con Parafilm sin añadir nada.

Almacenar los filtros (3 µm y Sterivex 0.22 µm) a −20 °C hasta su procesamiento en el laboratorio.

Lavar las líneas inmediatamente tras cada filtración: 1 L de agua potable, 1 L de cloro al 1% y 1 L de agua miliQ, descartando todo el líquido interior de las mangueras. Rociar con etanol al 70% el exterior de las mangueras entre cada muestra para evitar contaminación cruzada.

Aquatic on Castro Lab

DNA Extraction from Sterivex (0.22µm) or Polycarbonate Filter (3µm) (En Español)

1. Extracción de ADN

1.1 Materiales

1.2 Procedimiento

1.3 Preparación del buffer de lisis

Sampling and Filtration of Water from Mesocosm Experiments (En Español)

1. Recolección de muestras de agua

1.1 Materiales

1.2 Procedimiento

2. Filtración de las muestras

2.1 Materiales

2.2 Filtración para determinación de clorofila y nutrientes orgánicos e inorgánicos

2.3 Filtración para extracción de material genético