Protocols on Castro Lab

Extracción de ADN desde Muestras de Biofilm Subgingival/Submucoso (Periodontitis y Periimplantitis)

ecastron@utalca.cl (Eduardo Castro) — Thu, 23 Apr 2026 00:00:00 +0000

Creado por el Laboratorio Castro.

Contexto clínico

La periodontitis y la periimplantitis son enfermedades inflamatorias crónicas de origen microbiano que afectan los tejidos de soporte dentario y periimplantario, respectivamente. Ambas condiciones se caracterizan por una comunidad bacteriana subgingival/submucosa disbiótica, enriquecida con patógenos periodontales como Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola y Tannerella forsythia (complejo rojo), entre otras especies anaerobias [Paster et al., 2001; Yu et al., 2024]. El análisis del microbioma mediante secuenciación del gen ARNr 16S (regiones hipervariables V3-V4) permite caracterizar con alta resolución las comunidades microbianas asociadas a la enfermedad [Arredondo et al., 2023; Szafrański et al., 2014].

La selección del método de extracción de ADN es crítica: protocolos que incorporan lisis mecánica con beads de vidrio mejoran significativamente la recuperación de especies de difícil lisis, como Gram-positivas y microorganismos con pared celular robusta [Abusleme et al., 2014; Teng et al., 2018]. La combinación de lisis mecánica (bead beating), lisis enzimática (lisozima + proteinasa K) y purificación por columna de sílica es actualmente el enfoque recomendado para maximizar el rendimiento y la diversidad representada en muestras de placa subgingival [Vesty et al., 2017; Santamaria et al., 2025].

1. Toma de muestra

1.1 Pacientes

Las muestras se obtienen de pacientes con diagnóstico confirmado de periodontitis o periimplantitis según los criterios del Taller Mundial de Clasificación 2017 (Tonetti et al., 2018). Para periimplantitis, se selecciona el sitio con mayor profundidad de sondaje (≥ 5 mm con sangrado al sondaje y pérdida ósea radiográfica).

1.2 Materiales para toma de muestra

Curetas mini Gracey estériles (#11–12)
Tubos Eppendorf de 1.5 mL (estériles)
Buffer TE 1X (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)
Guantes de nitrilo sin polvo
Mascarilla y antiparras de protección
Algodones estériles para aislamiento relativo
Sonda periodontal calibrada
Jeringa de irrigación con suero fisiológico estéril

1.3 Procedimiento de toma de muestra

Realizar remoción de placa suprамucosa con algodones estériles antes de la toma de muestra para evitar contaminación cruzada.
Identificar el sitio de mayor profundidad de sondaje en cada implante con periimplantitis (o diente con periodontitis).
Con la cureta mini Gracey estéril (#11–12), raspar suavemente la pared del bolsillo para recolectar el biofilm submucoso/subgingival.
Depositar inmediatamente la muestra en un tubo Eppendorf de 1.5 mL conteniendo 300 µL de buffer TE 1X.
Mantener las muestras en frío (hielo) durante el procedimiento clínico.
Almacenar a −80 °C hasta su procesamiento.

Nota: La elección de curetas sobre puntas de papel mejora la diversidad microbiana recuperada y reduce el riesgo de contaminación con ADN exógeno [Beyer et al., 2017].

2. Extracción de ADN

2.1 Materiales

Reactivos:

Buffer de lisis (ver sección 2.4 para preparación)
Glass beads (beads de vidrio, 1 mm de diámetro)
Lisozima 100 mg/mL (Thermo Fisher, cat. 89833)
Proteinasa K 200 µg/mL
Kit de purificación Zymo Research (Zymo Bacterial/Fungal DNA Mini Prep™ o equivalente):
- Columnas de sílica con tubo colector
- DNA Pre-Wash Buffer
- DNA Wash Buffer
- DNA Elution Buffer
Agua libre de nucleasas

Equipamiento:

Vórtex
Termobloque con agitación (o baño de agua)
Centrífuga de microtubo (capacidad ≥ 10,000 × g)
Qubit 4 Fluorometer® con reactivos Qubit dsDNA HS Assay
Sistema de electroforesis capilar (para evaluación de integridad)
Micropipetas (p20, p200, p1000)
Puntas de micropipeta con filtro
Guantes de nitrilo sin polvo
Gradilla para tubos Eppendorf
Hielo

2.2 Procedimiento de extracción

Paso 1 — Lisis mecánica:

Retirar los tubos del almacenamiento a −80 °C y descongelar en hielo.
Agregar 500 µL de buffer de lisis a cada tubo.
Incorporar glass beads (1 mm de diámetro) hasta un volumen aproximado de 1 mL por tubo.
Agitar en vórtex a máxima velocidad durante 20 minutos a temperatura ambiente para promover la lisis mecánica.

La lisis mecánica con beads de vidrio es el único método que garantiza la recuperación de todas las especies bacterianas, incluyendo las de difícil lisis [Abusleme et al., 2014]. La combinación bead-beating + enzimas mejora la representación de la diversidad microbiana frente a métodos exclusivamente enzimáticos [Teng et al., 2018].

Paso 2 — Lisis enzimática (lisozima):

Agregar 60 µL de lisozima (100 mg/mL) a cada tubo.
Incubar a 40 °C durante 1 hora en termobloque.
Al finalizar la incubación, agitar brevemente en vórtex para resuspender el material celular lisado.

Paso 3 — Lisis proteolítica (proteinasa K):

Agregar 10 µL de proteinasa K (200 µg/mL) a cada tubo.
Incubar a 56 °C durante 1 hora para completar la lisis enzimática y liberar el material genético.

Paso 4 — Purificación con columna de sílica (Zymo Research):

Transferir todo el contenido del tubo a la columna de sílica ensamblada en su tubo colector.
Centrifugar a 10,000 × g durante 1 minuto 30 segundos.
Desechar el tubo colector. Trasladar la columna a un nuevo tubo colector.
Agregar 200 µL de DNA Pre-Wash Buffer.
Centrifugar a 10,000 × g durante 1 minuto 30 segundos. Desechar el eluido.
Agregar 500 µL de DNA Wash Buffer.
Centrifugar a 10,000 × g durante 1 minuto 30 segundos. Desechar el eluido.
Transferir la columna a un tubo Eppendorf limpio de 1.5 mL.
Agregar 40 µL de DNA Elution Buffer directamente sobre la membrana de la columna.
Incubar a temperatura ambiente durante 2–5 minutos.
Centrifugar a 10,000 × g durante 1 minuto para eluir el ADN.

2.3 Cuantificación y evaluación de calidad

Concentración: Cuantificar el ADN eluido mediante Qubit 4 Fluorometer® usando el kit Qubit dsDNA HS Assay Kit.
Integridad: Evaluar mediante electroforesis capilar (e.g., Agilent TapeStation o BioAnalyzer).
Almacenamiento: Conservar el ADN extraído a −20 °C para aplicaciones futuras.

Se recomienda alcanzar una concentración mínima de 1 ng/µL para asegurar la calidad del input para la construcción de librerías de secuenciación 16S.

2.4 Preparación del buffer de lisis

En un tubo o frasco estéril, mezclar:

Componente	Concentración final
Xantogenato (Sigma 254770)	1% p/v
Acetato de amonio	4 M
Tris-HCl pH 7.4	10% v/v
EDTA disódico 0.45 M pH 8	3.6% v/v

Completar con agua libre de nucleasas hasta el volumen final deseado. Cubrir con papel aluminio y almacenar a 4 °C por hasta 7 días.

3. Aplicaciones downstream

El ADN extraído mediante este protocolo es adecuado para:

Secuenciación de amplicones 16S rRNA (regiones hipervariables V3-V4 en plataforma Illumina MiSeq) [Vesty et al., 2017; Arredondo et al., 2023]
PCR cuantitativa (qPCR) para cuantificación de patógenos periodontales específicos (P. gingivalis, T. denticola, T. forsythia, F. nucleatum)
Secuenciación de longitud completa del gen 16S (plataformas PacBio SMRT) para mayor resolución taxonómica a nivel de especie [Buetas et al., 2024; Yu et al., 2024]
Metagenómica shotgun (con input mínimo adicional)

4. Consideraciones adicionales

Medio de almacenamiento: El buffer TE 1X a −80 °C preserva adecuadamente la integridad del ADN bacteriano en muestras de biofilm subgingival. Alternativas como la solución de Bead (buffer de preservación) son compatibles con kits de extracción con y sin bead-beating [Zhou et al., 2019].
Contaminación: Trabajar en área limpia, preferentemente cerca de mechero o en gabinete de bioseguridad. Incluir controles negativos de extracción en cada lote.
Número de muestras: Procesar muestras por lotes para estandarizar tiempos de incubación y centrifugación.

5. Referencias

Abusleme, L. et al. (2014). Influence of DNA extraction on oral microbial profiles obtained via 16S rRNA gene sequencing. Journal of Oral Microbiology, 6, 23990.
Arredondo, A. et al. (2023). Comparative 16S rRNA gene sequencing study of subgingival microbiota of healthy subjects and patients with periodontitis from four different countries. Journal of Clinical Periodontology, 50(3), 346–358.
Beyer, K. et al. (2017). Comparison of paperpoint and curette sampling of subgingival microbiome composition as analyzed by 16S rRNA gene amplicon sequencing. Journal of Oral Microbiology, 9(1), 1330097.
Buetas, E. et al. (2024). Full-length 16S rRNA gene sequencing by PacBio improves taxonomic resolution in human microbiome samples. BMC Genomics, 25, 76.
Lim, Y. et al. (2017). The oral microbiome in oral cancer. PloS One, 12(4), e0175439.
Paster, B.J. et al. (2001). Bacterial diversity in human subgingival plaque. Journal of Bacteriology, 183(12), 3770–3783.
Santamaria, P. et al. (2025). Impact of optimised sample preparation method on DNA recovery from subgingival plaque in a population with periodontitis. Archives of Oral Biology.
Szafrański, S.P. et al. (2014). High-resolution taxonomic profiling of the subgingival microbiome for biomarker discovery and periodontitis diagnosis. Applied and Environmental Microbiology, 81(4), 1047–1058.
Teng, F. et al. (2018). Impact of DNA extraction method and targeted 16S-rRNA hypervariable region on oral microbiota profiling. Scientific Reports, 8, 16321.
Vesty, A. et al. (2017). Evaluating the impact of DNA extraction method on the representation of human oral bacterial and fungal communities. PLoS ONE, 12(5), e0169877.
Yu, P.S. et al. (2024). Microbiome of periodontitis and peri-implantitis before and after therapy: Long-read 16S rRNA gene amplicon sequencing. Journal of Periodontal Research, 59(3), 541–552.
Zhou, X. et al. (2019). Storage media and not extraction method has the biggest impact on recovery of bacteria from the oral microbiome. Scientific Reports, 9, 4740.

Getting Started on McCartney — HPC User Guide

ecastron@utalca.cl (Eduardo Castro) — Thu, 23 Apr 2026 00:00:00 +0000

Version 0.2 — March 2026. This guide replaces v0.1.
Questions, password resets, software requests, or bugs? Contact the SysAdmins: Gabriel Ballesteros · gaballesteros@gmail.com | Valentín Berríos · v.berriosfarias@gmail.com

1. Overview

McCartney is a Linux-based HPC cluster running Slurm as its workload manager. It has no graphical interface — all interaction happens through a Bash command-line terminal. If you are new to the Linux command line, work through one of these tutorials before proceeding:

2. Hardware

McCartney consists of four compute nodes across two partitions, plus a dedicated storage node that also hosts the front-end (the machine you log into).

The front-end has only 4 GB RAM and 2 CPU cores — intentionally limited.
Do not run analyses on it. Use it only to write scripts, manage files, and submit jobs to the queue.

Partition: `basic`

Node	CPUs (cores)	RAM
n001	40	2 TB
n002	16	256 GB
n003	32	256 GB

Partition: `gpu`

Node	CPUs (cores)	RAM	GPU
g001	40	256 GB	NVIDIA RTX A5000 (24 GB VRAM)

Which node should I use?

Choose based on three factors:

How many CPU cores does my tool use?
How much RAM does my job need? (jobs requiring >256 GB must go to n001)
Does my tool use GPU acceleration? → --partition=gpu

3. Your Account

Accounts follow the format first initial + last name (all lowercase). Passwords are set to firstname + account creation date by default.

Example: A user named Paul McCartney, whose account was created on the 18th of June, receives:

username: pmccartney
password: paul18

Custom passwords are available on request — contact a SysAdmin.
Note: when you type your password in the terminal, no characters are displayed. This is normal.

4. Connecting via SSH

All connections use SSH (Secure Shell). You need:

Parameter	Value
Port	`20223`
Inside UTALCA Wi-Fi / wired	`172.22.0.21`
Outside UTALCA (home, 5G, Starlink, abroad)	`190.110.100.21`

The UTALCA-Visitas network does not work for SSH connections.

On macOS / Linux

Open a terminal and run:

# From inside the university network
ssh pmccartney@172.22.0.21 -p 20223

# From outside
ssh pmccartney@190.110.100.21 -p 20223

On Windows

SSH is built into Windows 10/11. Press Start, type cmd, open Command Prompt, and run the same command above.
Alternatively, install Windows Terminal for a better experience.

3-strike rule: entering the wrong password three times in a row will ban your IP address. If this happens, switch networks and contact a SysAdmin to unblock you.

5. Transferring Files

Windows — WinSCP (recommended)

Download WinSCP and fill in the connection details:

Field	Value
File protocol	SFTP
Host name	`172.22.0.21` (or `190.110.100.21` from outside)
Port	`20223`
User name	your username (e.g. `pmccartney`)
Password	your password

The left panel shows your local machine; the right panel shows the cluster. Drag and drop to transfer.

macOS / Linux — command line

# Copy a local file TO the cluster
scp -P 20223 myfile.fastq.gz pmccartney@172.22.0.21:/home/pmccartney/data/

# Copy an entire folder TO the cluster
scp -P 20223 -r my_reads/ pmccartney@172.22.0.21:/home/pmccartney/data/

# Copy a result FROM the cluster to your local machine
scp -P 20223 pmccartney@172.22.0.21:/home/pmccartney/results/output.tsv ./

You can also mount the cluster as a network drive in your file manager:

# Linux file manager → "Connect to server"
ssh://172.22.0.21

Faster large transfers — rsync

# Sync a folder, showing progress, over the custom port
rsync -avz --progress -e "ssh -p 20223" my_reads/ pmccartney@172.22.0.21:/home/pmccartney/data/

6. Software Modules

McCartney uses the Environment Modules system. Software is not available by default — you must load it before use.

# See all installed software
module avail

# Load a specific tool
module load NCBI-Blast
module load FastQC
module load Bowtie2

# See what you have loaded right now
module list

# Unload a module
module unload FastQC

# Unload everything
module purge

Do not install software in your home directory. If a tool you need is missing, contact Gabriel or Valentín — they will install it system-wide, along with any required databases.

Reference scripts with common module combinations are available on the cluster at:

/home/scripts-referencia/

7. The SLURM Job Scheduler

McCartney runs Slurm (Simple Linux Utility for Resource Management) to allocate compute resources fairly across all users. You do not run jobs directly — you submit them to a queue and Slurm starts them when the requested resources become free.

Over-requesting resources harms everyone. A job asking for 20 CPUs when your code uses only 1 blocks those CPUs for other users and forces your own job to wait longer for a slot. Estimate carefully.

Monitoring commands

# View all jobs currently running or queued
squeue

# View only your jobs
squeue -u pmccartney

# Check node availability (idle = free, alloc = fully busy, mix = partially free)
sinfo

# Cancel a job (find JOBID with squeue first)
scancel <JOBID>

# Cancel all your jobs at once
scancel -u pmccartney

`sinfo` state	Meaning
`idle`	Node is 100% free
`mix`	Node has some CPUs/RAM still available
`alloc`	Node is fully occupied
`drain`	Node is being taken offline by admin

Full documentation: slurm.schedmd.com/squeue.html · sinfo · scancel

8. Writing Job Scripts

Jobs are submitted with sbatch using a shell script (.sh) that begins with #SBATCH directives declaring the resources you need.

Common `#SBATCH` directives

Directive	Example	Meaning
`--job-name`	`--job-name=blast_run`	Label shown in `squeue`
`--partition`	`--partition=basic`	Which partition to use
`--nodes`	`--nodes=1`	Number of nodes
`--ntasks`	`--ntasks=1`	Number of parallel tasks
`--cpus-per-task`	`--cpus-per-task=16`	CPU cores per task
`--mem`	`--mem=64G`	RAM per node (K/M/G/T suffixes)
`--time`	`--time=24:00:00`	Max wall-clock time (HH:MM:SS)
`--output`	`--output=job_%j.out`	File for standard output (`%j` = job ID)
`--error`	`--error=job_%j.err`	File for standard error
`--array`	`--array=1-6`	Submit N identical jobs as an array
`--mail-type`	`--mail-type=END,FAIL`	Email on job end or failure
`--mail-user`	`--mail-user=pmccartney@utalca.cl`	Notification address

Full reference: slurm.schedmd.com/sbatch.html

9. Script Templates

Template A — Single core, low memory

Suitable for: simple scripts, R, Python, serial tools.

#!/bin/bash
#SBATCH --job-name=my_job
#SBATCH --partition=basic
#SBATCH --nodes=1
#SBATCH --ntasks=1
#SBATCH --cpus-per-task=1
#SBATCH --mem=4G
#SBATCH --output=output_%j.out
#SBATCH --error=output_%j.err

# Load required module(s)
module load <module_name>

# Your command
<command>

Submit with:

sbatch my_script.sh

Template B — Multi-core, high memory

Suitable for: assembly, read mapping (BWA, Bowtie2), database searches (DIAMOND, BLAST).

#!/bin/bash
#SBATCH --job-name=mapping_run
#SBATCH --partition=basic
#SBATCH --nodes=1
#SBATCH --ntasks=1
#SBATCH --cpus-per-task=16
#SBATCH --mem=64G
#SBATCH --time=24:00:00
#SBATCH --output=mapping_%j.log
#SBATCH --error=mapping_%j.err

module load Bowtie2

# Pass the thread count automatically from SLURM
THREADS=$SLURM_CPUS_PER_TASK

bowtie2 -p $THREADS \
 -x /path/to/index \
 -1 reads_R1.fastq.gz \
 -2 reads_R2.fastq.gz \
 -S output.sam

Template C — Job array (process multiple samples in parallel)

Slurm launches one independent copy of the script per array index. Use this whenever you have N samples that can be processed identically and independently — it is much more efficient than submitting N separate scripts.

#!/bin/bash
#SBATCH --job-name=fastqc_array
#SBATCH --partition=basic
#SBATCH --array=1-6 # launches 6 jobs
#SBATCH --cpus-per-task=16
#SBATCH --mem=64G
#SBATCH --time=04:00:00
#SBATCH --output=fastqc_%A_%a.out # %A = array job ID, %a = task index
#SBATCH --error=fastqc_%A_%a.err

# 1. Define sample list
SAMPLES=("Sample1" "Sample2" "Sample3" "Sample4" "Sample5" "Sample6")

# 2. Select this task's sample (SLURM_ARRAY_TASK_ID starts at 1, bash arrays at 0)
INDEX=$(($SLURM_ARRAY_TASK_ID - 1))
SAMPLE=${SAMPLES[$INDEX]}

# 3. Run
module load FastQC

mkdir -p fastqc_results

echo "Processing $SAMPLE at $(date)"
fastqc -t 16 -o fastqc_results/ reads/${SAMPLE}_R1.fastq.gz reads/${SAMPLE}_R2.fastq.gz
echo "Done at $(date)"

Learn more: Slurm job arrays documentation

Template D — Array with local scratch (fast I/O)

Copying data to the node’s local /scratch disk before processing avoids network bottlenecks on I/O-heavy jobs.

#!/bin/bash
#SBATCH --job-name=fastqc_scratch
#SBATCH --partition=basic
#SBATCH --array=1-6
#SBATCH --nodes=1
#SBATCH --ntasks=1
#SBATCH --cpus-per-task=16
#SBATCH --mem=64G
#SBATCH --time=04:00:00
#SBATCH --output=fastqc_%A_%a.out
#SBATCH --error=fastqc_%A_%a.err

SAMPLES=("Sample1" "Sample2" "Sample3" "Sample4" "Sample5" "Sample6")
INDEX=$(($SLURM_ARRAY_TASK_ID - 1))
SAMPLE=${SAMPLES[$INDEX]}

SUBMIT_DIR=$(pwd)
INPUT_DIR="${SUBMIT_DIR}/reads"
OUTPUT_DIR="${SUBMIT_DIR}/fastqc_results"

# Set up scratch space on the compute node
SCRATCH="/scratch/${SLURM_JOB_ID}_${SLURM_ARRAY_TASK_ID}"
mkdir -p $SCRATCH

# Cleanup scratch on exit (success or failure)
cleanup() { echo "Cleaning scratch..."; rm -rf "$SCRATCH"; }
trap cleanup EXIT

# Copy input data to scratch
cp ${INPUT_DIR}/${SAMPLE}_R1.fastq.gz $SCRATCH/
cp ${INPUT_DIR}/${SAMPLE}_R2.fastq.gz $SCRATCH/

# Run analysis on scratch
cd $SCRATCH
module load FastQC
fastqc -t 16 -o $SCRATCH/ ${SAMPLE}_R1.fastq.gz ${SAMPLE}_R2.fastq.gz

# Move results back to shared storage
mkdir -p $OUTPUT_DIR
mv ${SAMPLE}*_fastqc.{html,zip} $OUTPUT_DIR/

echo "Finished $SAMPLE at $(date)"

10. Using AI to Generate Script Drafts

Large language models (ChatGPT, Google Gemini, Claude) can generate solid SLURM script drafts. Use prompts like:

“Write a SLURM script for the basic partition requesting 64 GB RAM and 16 CPUs to run DIAMOND blastp on a protein FASTA file.”

Always review the generated script and verify that:

The partition name matches (basic or gpu)
Memory and CPU requests are realistic
The module names match what is installed on McCartney (module avail)

11. Best Practices

Do	Don’t
Run `sinfo` before submitting to gauge node availability	Run compute jobs directly on the front-end
Estimate memory needs — check tool documentation	Request 20× more RAM than needed
Use `$SLURM_CPUS_PER_TASK` instead of hardcoded thread counts	Hardcode `-t 16` if you might change `--cpus-per-task`
Set `--time` to a realistic upper bound	Leave `--time` unset (may block the queue)
Use `--array` for batches of similar samples	Submit dozens of identical `sbatch` calls
Redirect output to `.out` / `.err` files	Let job output flood the terminal
Clean up intermediate files when the job finishes	Leave hundreds of GB of temporary files

12. Useful Links

Resource	URL
Slurm official documentation	slurm.schedmd.com
`sbatch` man page	slurm.schedmd.com/sbatch.html
Job arrays guide	slurm.schedmd.com/job_array.html
Terminal basics (interactive)	sandbox.bio/tutorials/terminal-basics
Learning the Shell	linuxcommand.org/lc3_learning_the_shell.php
MIT Missing Semester	missing.csail.mit.edu
WinSCP (Windows file transfer)	winscp.net
Windows Terminal	aka.ms/terminal
HPC Carpentry (Slurm tutorial)	carpentries-incubator.github.io/hpc-intro

13. Getting Help

For any of the following, contact the SysAdmins directly:

Software installation or database setup
Password reset or new account creation
Node failures or unexpected job terminations
Access from a banned IP
Any doubt not covered here

Gabriel Ballesteros — gaballesteros@gmail.com
Valentín Berríos — v.berriosfarias@gmail.com

You can also query each Slurm command’s built-in manual page directly on the cluster:
man sbatch
man squeue
man sinfo

McCartney SLURM Script Generator

ecastron@utalca.cl (Eduardo Castro) — Thu, 23 Apr 2026 00:00:00 +0000

An interactive Shiny app that generates ready-to-submit SLURM batch scripts for the McCartney HPC cluster without having to remember syntax or look up documentation.

Launch Script Generator →

What it does

Select partition (basic or gpu), CPUs, RAM, and wall-clock time
Toggle job arrays — paste your sample names and the app writes the SAMPLES=(...) bash array automatically
Toggle scratch filesystem — the app wraps your command with copy-in / run / copy-back logic and a trap cleanup EXIT so scratch is always removed
Search and load any installed software module
Copy the finished script to the clipboard or download it as a .sh file

How to use

Click Launch Script Generator above
Fill in the sidebar — the script updates live in the right panel
Hit Download .sh and submit with sbatch your_script.sh

For the full cluster user guide (SSH, file transfer, module system, script templates) see the McCartney HPC User Guide.

DNA Extraction from Sterivex (0.22µm) or Polycarbonate Filter (3µm) (En Español)

ecastron@utalca.cl (Eduardo Castro) — Mon, 17 Jul 2023 00:00:00 +0000

Creado por el Laboratorio Castro.

1. Extracción de ADN

1.1 Materiales

Placa petri
Sonicador
Bisturí
Micropipeta (p1000, p200, p20)
Guantes
Buffer de lisis
Lisozima (100 mg/µl)
Tubo de molienda
Beads
Proteinasa K (200 mg/µl)
SDS 10%
Solución fenol-cloroformo-alcohol isoamílico
Isopropanol
Etanol 70%
Pinzas
Puntas micropipeta (p1000, p200, p20)
Tijeras de podar
Tubos (1.5 mL)
Tubos (2 mL)

1.2 Procedimiento

Retirar con pinzas estériles el filtro de policarbonato (3 µm) del tubo Falcon y depositarlo en una placa de Petri. Utilizando un bisturí y una punta de micropipeta P1000, cortar el filtro en pequeños trozos y transferirlos a un tubo de 2 mL con beads de borosilicato (Merck, Z273619-1EA). Por lo general, el filtro mantiene gotas residuales de filtración; transfiera todo el líquido al tubo con beads.

Para colapsar la cubierta externa del filtro Sterivex (0.22 µm), se deben utilizar tijeras de podar previamente esterilizadas con etanol al 70%, partiendo desde el extremo de salida del filtro. Depositar el filtro en una placa de Petri estéril y utilizar un bisturí y una punta de micropipeta P1000 para cortar el filtro en pequeños trozos. Transferir los trozos a un tubo con beads. Al igual que con el filtro de 3 µm, el filtro Sterivex suele presentar líquido residual; transferir todo el volumen al tubo con beads.

Considerar el uso de campana o mechero durante el procedimiento.

Añadir 750 µL de buffer de lisis y 60 µL de lisozima (100 µL/mL) (Thermo Fisher, 89833) al tubo con los beads. Agitar inmediatamente en el vórtex a máxima velocidad durante 10 minutos. Luego, incubar los tubos a 40 °C durante 1 hora en el termobloque, agitando moderadamente en el vórtex cada 30 minutos.

Retirar los tubos del termobloque, agregar 5 µL de proteinasa K (200 mg/mL) y 75 µL de SDS al 10%. Incubar nuevamente durante 1 hora a 55 °C, agitando con el vórtex suavemente cada 30 minutos.

Finalizada la incubación, centrifugar a 12.000 × g durante 5 minutos a 4 °C y transferir el sobrenadante completo a un tubo Eppendorf de 1.5 mL.

Agregar 500 µL de solución fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1), mezclar por inversión y centrifugar a 12.000 × g durante 5 minutos a 4 °C. Recuperar la fase acuosa superior y transferirla a un tubo Eppendorf de 1.5 mL.

Repetir la extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico. Agregar 500 µL de isopropanol frío (−20 °C) al tubo, mezclar por inversión e incubar toda la noche a −20 °C.

Centrifugar a 12.000 × g durante 25 minutos a 4 °C. Descartar cuidadosamente el sobrenadante y agregar 500 µL de etanol al 70%. Centrifugar a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C. Descartar el etanol sin remover el pellet. Repetir el lavado con 500 µL adicionales de etanol al 70%.

Eliminar todo el remanente de etanol secando el tubo en el termobloque a 40 °C durante 40 minutos.

Resuspender el pellet en 60 µL de agua libre de nucleasas y cuantificar.

1.3 Preparación del buffer de lisis

En un shot estéril, mezclar:

Xantogenato (Sigma 254770) — 1% p/v
Acetato de amonio — 4 M
Tris-HCl pH 7.4 — 10% v/v
EDTA disódico 0.45 M pH 8 — 3.6% v/v

Completar con agua libre de nucleasas hasta el volumen final deseado. El buffer puede guardarse cubierto con papel aluminio a 4 °C por hasta 7 días.

Sampling and Filtration of Water from Mesocosm Experiments (En Español)

ecastron@utalca.cl (Eduardo Castro) — Wed, 31 May 2023 00:00:00 +0000

Creado por el Laboratorio Castro.

1. Recolección de muestras de agua

1.1 Materiales

Generador Honda EU10i
Alargador
Electrobomba con rodete periférico
Malla de 50 µm (Sefar)
Manguera para bomba eléctrica (FLEXHOSE PVC FIBER REINFORCED 70 PS)
Cuerda (~60 m)
Bidones de 35 L
Sensor Hobo Onset Temp/Light
Amarracables (pequeños y medianos)
Guantes
Botellas J 125 mL
Multiparámetro (HANNA HI9829)
Caja con diversas herramientas
Jarro de 1 L
Paños de limpieza
Cinta americana (DuckTape)
Jeringa 50 mL

1.2 Procedimiento

El día anterior al muestreo, lavar todo el material (bidones y jarro) con agua corriente (1 vez), hipoclorito de sodio al 1% (1 vez) y agua miliQ (3 veces).

Previo a la extracción de agua, se deben amarrar los sensores Hobo a la electrobomba utilizando y ajustando los amarracables para evitar movimiento del sensor. Asegurarse de que la manguera esté bien apretada a la entrada de la bomba para evitar pérdidas o colapso de la manguera; en el extremo de salida se acopla la malla de 50 µm.

Sumergir la electrobomba en la columna de agua sin que esté encendida. Fijar con cuerdas si es necesario para evitar movimiento pendular. Antes de encender el generador Honda EU10i, asegurarse de que la palanca lateral se encuentre hacia atrás (mayor potencia), el botón trasero indique la figura del conejo, y la perilla esté en ON. Previo al llenado de bidones, esperar 1 minuto para ambientar la manguera con el agua del entorno. Como recomendación, el extremo de salida de la manguera puede fijarse con un nudo de anclaje hacia el arco de la plataforma.

Antes de comenzar a llenar los bidones, ambientar la manguera y los bidones 3 veces con el agua que se muestreará. Luego de extraer 35 L de agua, recolectar agua con el jarro de 1 L para medir parámetros fisicoquímicos con el multiparámetro (HANNA HI9829). Adicionalmente, recolectar agua en jeringas de 50 mL para ser utilizadas en el procedimiento de filtración de nutrientes inorgánicos (ver punto 2).

Una vez recolectada la muestra, apagar el generador y desmontar la electrobomba, evitando que bombee aire (lo que interferiría en su correcto funcionamiento).

Trasladar inmediatamente las muestras recolectadas a la cámara fría (4 °C) hasta el comienzo de la filtración.

Considerar el uso de indumentaria impermeable, dado que es imposible no terminar mojado.

2. Filtración de las muestras

2.1 Materiales

Bomba peristáltica MasterFlex
Manguera MasterFlex 06509-25 Tygon (transparente)
Manguera MasterFlex 6424-25 (blanca)
Cabezales y fierritos (×4)
DNA/RNA Shield
Tubos Falcon 15 mL
Tubos Falcon 50 mL
Filtros 0.22 µm (pirinolas)
Filtros GFF 25 mm
Filtros GFF 25 mm muflados
Filtros Sterivex PES (0.22 µm)
Filtros de membrana Isopore Type 3.0 µm
Parafilm
Micropipeta P1000
Caja de puntas P1000
Marcador permanente (×3)
Pinzas planas
Portafiltro Swinnex 25 mm
Portafiltro Swinnex 47 mm
Pipetas plásticas 20 mL
Amarracables
Cloro 1%
Etanol 70%
Agua miliQ

2.2 Filtración para determinación de clorofila y nutrientes orgánicos e inorgánicos

La filtración de clorofila y nutrientes orgánicos se realiza con los portafiltros Swinnex de 25 mm, considerando 1 L de muestra por filtración y dos líneas con portafiltros. Conectar la manguera MasterFlex 06509-25 Tygon (transparente) en la parte anterior del portafiltro (hacia la muestra) y la manguera MasterFlex 6424-25 (blanca) en la parte posterior. Luego de armar las líneas, asegurar las mangueras en la bomba peristáltica sin apretarlas en exceso. Colocar con pinzas un filtro GFF 25 mm para la línea de clorofila y un filtro GFF 25 mm muflado para la línea de nutrientes orgánicos. Al momento de filtrar, se recomienda aplicar 130 rpm si la muestra no presenta turbidez significativa; de lo contrario, reducir la velocidad hasta 60 rpm.

Al finalizar, doblar cada filtro hacia adentro en dos, envolver en papel aluminio y guardar en tubos de 15 o 50 mL a −20 °C hasta su procesamiento en el laboratorio. Lavar inmediatamente las mangueras y el portafiltro Swinnex de 25 mm con 1 L de agua potable, 1 L de cloro al 1% y 1 L de agua miliQ.

Para determinar la concentración de nutrientes inorgánicos, filtrar 100 mL de muestra utilizando una jeringa de 50 mL. Ambientar 3 veces la jeringa y las botellas J antes de comenzar. Acoplar el filtro de 0.22 µm (pirinola) y filtrar hasta completar 100 mL en las botellas J. Guardar las botellas J a −20 °C para análisis posterior.

2.3 Filtración para extracción de material genético

La filtración para extracción de material genético se realiza con los portafiltros Swinnex de 47 mm. Para aumentar el largo de la manguera de entrada (transparente), acoplar una pipeta de 10 mL que vaya directamente a la muestra. Colocar el filtro de membrana Isopore Type 3 µm en el portafiltro Swinnex de 47 mm. Para finalizar el ensamblaje de la línea, unir el filtro Sterivex 0.22 µm a la boca de la manguera de salida (blanca). Ajustar las conexiones de las mangueras hacia y desde los filtros con amarracables para evitar pérdida de volumen.

Para filtraciones con objetivo de extracción de ADN, no superar los 120 rpm; si la muestra presenta turbidez, reducir hasta 60 rpm.
Para filtraciones con objetivo de extracción de ARN, no superar los 80 rpm; reducir hasta 50 rpm si la muestra está turbia.

El volumen de filtración por muestra es de 5 a 10 L, o hasta la saturación del filtro Sterivex 0.22 µm. Monitorear continuamente las mangueras para evitar fugas.

Una vez filtrado el volumen o saturado el filtro Sterivex, detener la bomba peristáltica y desacoplar el portafiltro Swinnex de 47 mm para retirar el filtro de membrana de 3 µm. Doblarlo hacia adentro dos veces y guardarlo en un tubo Falcon de 15 mL:

Si se extraerá ARN: añadir 500 µL de DNA/RNA Shield al tubo.
Si se extraerá ADN: guardar el filtro sin añadir nada.

Desacoplar el filtro Sterivex de la manguera de salida y descartar el líquido interior sacudiéndolo suavemente. Sellar la salida con Parafilm:

Si se extraerá ARN: añadir 500 µL de DNA/RNA Shield y sellar la entrada con Parafilm.
Si se extraerá ADN: sellar la entrada con Parafilm sin añadir nada.

Almacenar los filtros (3 µm y Sterivex 0.22 µm) a −20 °C hasta su procesamiento en el laboratorio.

Lavar las líneas inmediatamente tras cada filtración: 1 L de agua potable, 1 L de cloro al 1% y 1 L de agua miliQ, descartando todo el líquido interior de las mangueras. Rociar con etanol al 70% el exterior de las mangueras entre cada muestra para evitar contaminación cruzada.

Capturing microbes with a Coriolis instrument and nucleic acid extraction (En Español)

ecastron@utalca.cl (Eduardo Castro) — Thu, 27 Apr 2023 00:00:00 +0000

Updated April 2023. Created by Dr. Sergio Guajardo.

1. Recolección de muestras de aire.

1.1. Materiales.

Coriolis µ
Base para muestreo prolongado
Trípode
Fuente de energía (corriente o generador Honda EU10i)
Botella de inyección con filtro de 0.2 µm
Mangueras de inyección
Cono de recolección estéril (autoclavado) o lavado (Agua bidestilada estéril apirógena, Hipoclorito de sodio 1%, etanol 70%)
Tampón de recolección estéril (Glicerol 2% autoclavado) idealmente diluir el glicerol en agua bidestilada estéril apirógena o agua miliQ.
Tubos cónicos de 15 mL estériles.
Criotubos de 1.5 mL
Micropipeta P1000
Puntas P100 estériles con filtro
RNA later
Agua bidestilada estéril apirógena o agua miliQ
Hipoclorito de sodio 1%
Etanol 70%
Toalla de papel
Espátula delgada

1.2 Procedimiento.

Ensamblar el equipo Coriolis µ (incluyendo el cono de recolección) siguiendo las instrucciones descritas en el manual del fabricante y montar sobre base de alimentación para muestreo prolongado (instalada previamente en trípode). Revisar que la entrada de la boquilla de recolección quede en orientación contraria al asa del equipo.

Encender el equipo manteniendo presionado el botón con el símbolo “√” de color verde hasta que aparezca el dialogo de autotest. Una ves concluidos los autotest, el equipo esta listo para funcionar. Llenar el cono de colección usando la función priming del equipo, a la que se accede presionando la flecha que apunta hacia arriba “^”. Para llenar el cono de colección mantener presionado el botón con el símbolo “√” de color verde hasta completar 7.5 mL (según graduación del cono). Para salir del modo priming se debe presionar el botón de flecha hacia abajo “v”.

Una vez devuelta a la pantalla principal establecer el tiempo de recolección (240 min), velocidad de recolección (300L/min) y tiempo de espera (0 min). Luego comenzar recolección de la muestra donde aparecerá la opción de seleccionar el volumen de inyección de tampón por minuto.

El volumen de tampón a inyectar depende de dos variables principales, la temperatura y humedad relativa, por lo que es recomendable probar el volumen que se inyectara. Para determinar el volumen correcto se debe muestrear sin inyectar tampón, registrando el volumen inicial y el final luego de 10 minutos de muestreo, dividiendo el volumen perdido por 10 se obtendrá el volumen de inyección. Si no es posible determinar el volumen de inyección, un buen punto de partida son 0.5 mL/min. Revisar cada 0.5-1 hora de muestreo para ajustar volumen de inyección (pausando el equipo con el botón “√” de color verde) y evitar que el volumen de tampón en el cono sobrepase los 10 mL durante el periodo de muestreo y 7,5 mL al final del muestreo.

Cuando el tiempo de muestreo haya concluido (240 min) el equipo se detendrá solo, luego de esto revisar el informe de corrida y apagar presionando el botón “X” de color rojo.

Es importante que el volumen de recolección final sea 7,5 mL (si el volumen es menor, se puede usar la función priming para completar). Agregar RNA later a una concentración final de 25% v/v (2,5 mL de RNA later por 7,5 mL de muestra) utilizando micropipeta P1000 y puntas con filtro estériles. Trasvasar a un tubo de 15 mL estéril y guardar a 4ºC por máximo una semana. Para periodos de almacenamiento mayores se recomienda guardar a -20 ºC.

1.2 Limpieza del equipo.

Una vez terminada la recolección es necesario limpiar algunas partes del equipo, para esto se usará hipoclorito de sodio al 1% (solución debe estar fresca, menos de 3 días), agua bidestilada apirógena y etanol 70%. Se limpiará la cañería metálica, la boquilla de colección, las mangueras de inyección, la botella de tampón y los conos de recolección. Limpiar primero con hipoclorito de sodio al 1%, poner especial cuidado con la boquilla que usualmente junta polvo y suciedad. De ser necesario se puede eliminar la suciedad con una espátula envuelta en toalla de papel remojada en hipoclorito de sodio. Luego enjuagar con agua bidestilada apirógena y por último lavar con etanol al 70% dejando secar al aire. Adicionalment, en caso de estar en laboratorio, las piezas se autoclavan envueltas en papel kraft y se secan en horno de secado.

Para “limpiar” el interior del equipo, se debe cargar el cono con 15 mL de etanol 70% y dejar el equipo muestreando (sin inyección de volumen) hasta que el cono quede seco (siempre queda un remanente). Luego de esto apagar el equipo y limpiarlo exteriormente con toalla de papel y etanol 70%.

2. Extracción de ácidos nucleicos.

2.1. Materiales.

Filtro 100 kDa (UFC810024, Merck o VS04T4, Sartorius)
Criotubo de 1.5 mL
Solución PBS-BSA 1% (37525, Thermo)
Vortex de 1500 rpm (88880017, Thermo)
Parafilm
Micropipeta P200
Micropipeta P1000
Puntas estériles con filtro de 200 µL
Puntas estériles con filtro de 1000 µL
DNeasy PowerSoil Pro Kit (47014, Qiagen)
Trizol LS (10296, Thermo)
Cloroformo (102445, Merck)
Etanol (100983, Merck)
E.Z.N.A.® MicroElute RNA Clean-up Kit (R6247, Omega Bio-Tek)
TURBO DNA-free™ Kit (AM1907, Invitrogen)
Qubit dsDNA HS Assay Kit (Q32854, Invitrogen)
Qubit RNA HS Assay Kit (Q32852, Invitrogen)

2.2 Concentración de la muestra.

Para extraer ácidos nucleicos es necesario concentrar las muestras, por lo que se utilizará filtración tangencial usando un dispositivo de 100 kDa. El filtro tangencial debe ser preparado antes de su utilización, para esto llenar con agua bidestilada estéril y centrifugar a 3000g. Eliminar cualquier remanente de agua e incubar el filtro con 2 mL de PBS-BSA 1% por al menos 4 horas a 4 ºC. Eliminar el PBS-BSA y lavar el filtro 3 veces con agua bidestilada estéril dejando el filtro listo para ser usado. Trasvasar 4 mL de la muestra al filtro tangencial y centrifugar por 2 minutos a 1500g. Rellenar el filtro con muestra y centrifugar por 2 minutos a 1500g, repetir hasta que en el filtro solo queden 500 µL de muestra. Cada vez que se rellena el filtro es necesario balancear con respecto al contrapeso o el resto de los tubos. Sacar el filtro del tubo colector y cubrir el filtro exterior con Parafilm. Agitar por vortex a 1500 rpm durante 1 minuto, y recuperar el volumen con una micropipeta P200 en un criotubo de 1.5 mL resuspendiendo suavemente. Agregar 500 µL de el liquido filtrado (el que quedo en el tubo colector) y repetir la agitación por vortex, recuperando el volumen con una micropipeta P200 en el mismo criotubo. A final de este paso se debe tener un criotubo con 1 mL de muestra.

2.3 Extracción de ADN.

Para extraer ADN utilizaremos el kit DNeasy PowerSoil Pro Kit (47014, Qiagen) utilizando como volumen de partida 250 a 500 µL de la muestra concentrada en el paso anterior. El material de partida es liquido por lo que al usar un volumen mayor a 250 µL es posible que las distintas soluciones del kit se diluyan con respecto a su concentración optima. La extracción se realiza siguiendo las instrucciones del fabricante excepto si se usa mas de 500 µL de muestra inicial. En este caso se hará dos extracciones de 250 µL y se juntaran en una sola columna para su elución.
El ADN extraído se cuantificará utilizando un fluorimetro Qubit y el kit para cuantificación de ADN doble hebra de alta sensibilidad (Q32854, Invitrogen). La concentración mínima necesaria para secuenciar por shotgun son 10-100 ng totales de ADN.

2.4 Extracción de ARN.
Para extraer ARN se debe utilizar el total de la muestra (1mL) para esto se debe dividir la muestra en 4 alícuotas de 250µL en tubos de 1.5 mL.
A cada tubo con 250 µL de muestra agregar 750 µL de Trizol LS frio y resuspender por pipeteo suave.
Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente para completar la lisis y agregar 200 µL de cloroformo mezclando el tubo por inversión.
Incubar por 3 minutos y centrifugar 15 minutos a 12.000g en centrifuga refrigerada a 4 ºC.
Recuperar la fase acuosa (superior) y proseguir con la limpieza del ARN usando el kit E.Z.N.A (R6247, Omega Bio-Tek).
Añadir 1 volumen de etanol absoluto (100983, Merck) por cada volumen de muestra (250 µL de etanol por 250µL de muestra) y mezclar por inversión.
Pasar la muestra ya mezclada con etanol (la capacidad máxima de la columna es de 700 μL, se pueden cargar volúmenes mayores sucesivamente) por la columna del kit E.Z.N.A (R6247, Omega Bio-Tek) siguiendo las instrucciones del fabricante “Centrifugar a 10.000g durante 15 segundos a temperatura ambiente”. Repetir este paso hasta que toda la muestra haya sido pasada por la columna y seguir con el protocolo “Desalting Protocol” del fabricante en el paso 7.
Una vez eluido el ARN, esté se tratará con TURBO DNase (AM1907, Invitrogen) para eliminar el ADN remanente siguiendo las instrucciones del fabricante.
El ARN extraído se cuantificará utilizando un fluorímetro Qubit y el kit para cuantificación de ARN de alta sensibilidad (Q32852, Invitrogen). La concentración mínima necesaria para secuenciar por shotgun son 500 ng totales de ARN.

Sampling the rhizosphere and extracting nucleic acids for viromes and metagenomes (En Español)

ecastron@utalca.cl (Eduardo Castro) — Thu, 27 Apr 2023 00:00:00 +0000

Updated April 2023. Created by Dr. Sergio Guajardo.

1. Recolección de muestras de suelo.

1.1. Materiales.

Bolsas para muestras estériles de 1L
Pala
Pala portátil o de jardineria
Etanol 70%
Toalla de papel
Estacas
Cordín
Regla de acero
pHmetro para suelo (HI981030, HANNA)
Medido de Conductividad para suelo (HI98331, HANNA)
Guantes de latex

1.2. Procedimiento

Determinar un sitio de muestreo que contenga un numero suficiente de plantas (al menos 3 por especie) y establecer un punto central en el área de muestreo clavando una estaca para demarcarlo. Amarrar un cordín de tres metros a la estaca y tomar muestras dentro de este radio en todas las direcciones de forma aleatoria. Se considerarán como distintos sitios de muestreo, aquello lugares cuyos centros estén separados por 80-100 metros de distancia.

Para cada sitio de muestreo tomar el mismo numero de tipo de muestras distintas, por ejemplo, si son dos especies vegetales se recolectarán 3 rizósferas de la especie A, 3 rizósferas de la especie B y 3 muestras de suelo descubierto libre de plantas.

¡Utilizar guantes de latex!

Con la pala remover la zona superficial a muestrear, eliminado guijarros y material vegetal muerto. Medir el pH y la conductividad del suelo con el pHmetro (HI981030) y el medidor de conductividad (HI98331) respetivamente. Para esto hacer un agujero de 20 centímetros con la regla de acero y llenar con agua bidestilada estéril, insertar el pHmetro y luego el medidor de conductividad en el agujero con agua, medir y registrar.

Enterrar la pala en el suelo en un ángulo de 90 grados, sacar la pala verticalmente y nuevamente enterrar la pala en 90 grados ~5 cm atrás del primer agujero. Inclinar la pala hacia atrás para extraer un “core” de suelo. Con un cuchillo limpio (tanol al 70% y toalla de papel) seleccionar el suelo que esta entre 5 y 15 cm y guardar en una bolsa de muestra estéril.

En el caso del suelo rizosférico, remover la planta completa haciendo cortes con la pala en 90 grados por alrededor de la planta. Si es posible, remover la parte aérea de planta en terreno con un cuchillo y guardar las raíces con el suelo asociado en una bolsa estéril.

Limpiar la pala y el cuchillo entre cada muestra con etanol al 70% y toalla de papel.

2. Extracción de ácidos nucleicos para metagenomas celulares.

2.1 Materiales.

Pinzas
Espátula
Tijera quirúrgica
Tamiz Cisa de 4.75 mm (#4) y de 2 mm (#10).
Colador de células de 100 μm estéril (EZFlow® Cell Strainer) o gasa estéril.
Placas de Petri desechables
Tubos cónicos de 50mL estériles
Buffer PBS 1X
Criotubos 1.5 mL

2.2 Procedimiento.

Todo este procedimiento debe realizarse en campana de flujo laminar en condiciones de esterilidad.

Para extraer ácidos nucleicos es necesario separar el suelo rizosférico del suelo que no esta unido fuertemente a las raíces. Para esto, tomar la planta con una pinza y sacudir fuertemente dentro de la bolsa de muestreo en una campana de flujo laminar. El suelo que quedo unido a las raíces será considerado suelo rizosférico y el que se soltó dentro de la bolsa se denominará RSS.

Las raíces que contienen el suelo rizósferico serán separadas y depositadas en un tubo cónico de 50 mL que contiene 15 mL de buffer PBS 1X usando pinza y tijera. Mezclar por vortex suave 2 minutos y trasvasar la suspensión de rizósfera a un tubo nuevo con un colador de células o gasa esteril. Agregar 15 mL de buffer PBS 1X al tubo que contiene las raíces y mezclar por vortex 2 minutos, trasvasando el contenido al mismo tubo del paso anterior con un colador de células o gasa estéril (repetir 2 veces).

Centrifugar el tubo con la rizósfera resuspendida por 10 minutos a 4000g en centrifuga refrigerada a 4 ºC. Eliminar el sobrenadante y guardar el tubo con el pellet a -20 ºC.

Tomar 0.5 mL de pellet con una espátula estéril depositándolo en un criotubo, repetir el proceso con 0.5 mL de pellet adicionales para obtener un total de ~1 gramo de rizósfera.

Para el RSS y el suelo descubierto mezclar cada bolsa de muestra por agitación y cribar una parte del RSS y suelo utilizando un tamiz de malla de acero de 4.75 y 2 mm. Recuperar el suelo en una bolsa de muestra esteril abierta (abrir la bolsa a su maxima extención con tijera) y transferir a un tubo conico de 50 mL y guardar a -20 ºC.

Con una espátula esteril tomar 0.5 mL de suelo depositándolo en un criotubo, repetir con 0.5 mL adicionales para obtener un total de ~ 1 gramo de RSS o suelo.

Todo el material de metal incluyendo tamiz, espatulas, pinzas y tijeras deben ser esterilizadas entre cada muestra utlizando etanol 70% y flameando el material en la llama del mechero.

2.3 Extracción de ADN

Para extraer ADN utilizaremos el kit DNeasy PowerSoil Pro Kit (47014, Qiagen) utilizando 1 gramo de suelo, RSS o rizósfera (para suelos más ricos en materia orgánica se puede partir de 250 mg y utilizar una sola columna).

La extracción se realiza siguiendo las instrucciones del fabricante excepto porque se harán dos extracciones de 500 mg cada una y se juntarán en una sola columna para su elución.

El ADN extraído se cuantificará utilizando un fluorímetro Qubit y el kit para cuantificación de ADN doble hebra de alta sensibilidad (Q32854, Invitrogen). La concentración mínima necesaria para secuenciar por shotgun son 10-100 ng totales de ADN.

3. Extracción de ácidos nucleicos para metagenomas virales.

3.1 Materiales.

Pinzas
Espátula
Tijera quirúrgica
Tamiz de 5 mm de acero (Tamices Cisa #4).
Placas de Petri desechables
Tubos cónicos de 50mL estériles
Tampón AKC’ (Citrato de potasio 1% P/V, PBS 1X 10% V/V, Sulfato de Magnesio 150 mM, pH 7)
Filtros Sterivex 0.2 µm PES (SVGP01050, Merck)
Jeringas esteriles de 50 mL
DNAsa I (A3778, ITW Reagents)
EDTA 1M
Filtro 100 kDa (UFC810024, Merck o VS04T4, Sartorius)
PEG8000 (V3011, Promega)
NaCl
DNeasy PowerSoil Pro Kit (47014, Qiagen)
Micropipeta P1000
Micropipeta P200
Puntas estériles con filtro de 200 µL
Puntas estériles con filtro de 1000 µL
Solución PBS-BSA 1% (37525, Thermo)

3.2 Procedimiento.

Para las extracciones de ADN viral se necesita un mínimo de 10 gramos de suelo rizosférico o suelo descubierto por lo que para el suelo rizosférico no es posible separar la rizósfera y el RSS.

Para el suelo rizosferico tomar la planta con una pinza y cortar las raíces con el suelo adherido sin sacudir. Cribar por malla de acero de 5 mm, recuperar el suelo rizosférico tamizado en placa de Petri.

Para el suelo descubierto, mezclar agitando la bolsa y cribar por malla de acero de 5 mm, recuperar el suelo tamizado en placa de Petri.

Resuspender 10 gramos de suelo rizosférico o suelo en 15 mL de tampón AKC’ y mezclar por inversión durante 30 segundos para incubar a 4 ºC por toda la noche.

Agitar por vortex a velocidad media 1 minuto, luego agitar de forma horizontal en agitador orbital a 400 rpm por 30 minutos.

Centrifugar a 3000g por 10 minutos en centrifuga refrigerada a 4 ºC y recuperar el sobrenadante en un tubo nuevo.

Volver a resuspender el pellet de suelo rizosférico o suelo en 10 mL de tampón AKC’ y en agitar en el agitador orbital a 400 rpm por 30 minutos.

Centrifugar a 3000g por 10 minutos en centrifuga refrigerada a 4 ºC y recuperar el sobrenadante en un tubo nuevo.

Volver a resuspender el pellet en 10 mL de tampón AKC’ y repetir los pasos de agitación y centrifugado.

Al final de este proceso se debería tener un total de 30 mL de sobrenadante por cada 10 gramos de suelo rizosférico o suelo descubierto.

Filtrar los 30 mL de sobrenandante por un filtro Sterivex de 0.2 µm PES usando una jeringa de 50 mL.

Tratar con DNAsa I 3000U por 10 gramos de suelo durante toda la noche a 4 ºC, inactivar la DNAsa con EDTA a una concentración final de 100mM.

Concentrar la muestra utilizando filtración tangencial en filtros de 100 kDa o por precipitación con PEG8000, dependiendo del tipo de muestra.

Si el método elegido es filtración tangencial, el filtro debe ser preparado antes de su utilización, para esto llenar con agua bidestilada estéril y centrifugar a 3000g. Eliminar cualquier remanente de agua e incubar el filtro con 2 mL de PBS-BSA 1% por al menos 4 horas a 4 ºC. Eliminar el PBS-BSA y lavar el filtro 3 veces con agua bidestilada estéril dejando el filtro listo para ser usado. Trasvasar 4 mL de la muestra por vez al filtro tangencial y centrifugar por 2 minutos a 1500g. Rellenar el filtro con muestra y centrifugar por 2 minutos a 1500g, repetir hasta que en el filtro solo queden 500 µL de muestra. Cada vez que se rellena el filtro es necesario balancear con respecto al contrapeso o el resto de los tubos. Si luego de 2 minutos de centrifugación el volumen no ha disminuido, se puede aumentar la velocidad de centrifugación a 3000g y el tiempo de centrifugación a lo que sea necesario.

Sacar el filtro del tubo colector y cubrir el filtro exterior con Parafilm. Agitar por vortex a 1500 rpm durante 1 minuto, y recuperar el volumen con una micropipeta P200 en un criotubo de 1.5 mL resuspendiendo suavemente. Agregar 500 µL de el liquido filtrado (el que quedo en el tubo colector) y repetir la agitación por vortex, recuperando el volumen con una micropipeta P200 en el mismo criotubo. A final de este paso se debe tener un criotubo con 1 mL de muestra.

En el caso de utilizar PEG8000, añadir solucion de PEG8000-NaCl (*20% PEG8000, NaCl 2,5 M) al sobrenadante en una razón de 1:1 (1 volumen de PEG8000-NaCl por 1 volumen de sobrenadante filtrado) e incubar a 4 ºC durante toda la noche. Centrifugar las muestras a 10000g durante 30 min (o 5000g por 1 hora) y eliminar el sobrenadante con micropipeta (ser cuidadoso porque el pellet puede ser no visible). Resuspender el pellet con 750 µL de tampón PowerBeads del kit DNeasy PowerSoil Pro (47014, Qiagen).

*Preparar la solución disolviendo primero el NaCl y luego el PEG8000 en agitador magnético)

3.3 Extracción de ADN.

Para extraer ADN utilizaremos el kit DNeasy PowerSoil Pro Kit (47014, Qiagen) utilizando como volumen de partida 2x500 µL de la muestra concentrada en el paso anterior (filtración tangencial). El material de partida es liquido por lo que al usar un volumen mayor a 250 µL es posible que las distintas soluciones del kit se diluyan con respecto a su concentración optima. La extracción se realiza siguiendo las instrucciones del fabricante excepto si se usa mas de 500 µL de muestra inicial. En este caso se hará dos extracciones de 500 µL y se juntaran en una sola columna para su elución.

Si la concentración de partículas virales se hizo con PEG8000, trasvasar el pellet resuspendido en el tampón de PowerBeads al tubo de PowerBeads para continuar la extracción siguiendo las instrucciones del fabricante.

El ADN extraído se cuantificará utilizando un fluorimetro Qubit y el kit para cuantificación de ADN doble hebra de alta sensibilidad (Q32854, Invitrogen). La concentración mínima necesaria para secuenciar por shotgun son 10-100 ng totales de ADN.

Protocols on Castro Lab

Extracción de ADN desde Muestras de Biofilm Subgingival/Submucoso (Periodontitis y Periimplantitis)

Contexto clínico

1. Toma de muestra

1.1 Pacientes

1.2 Materiales para toma de muestra

1.3 Procedimiento de toma de muestra

2. Extracción de ADN

2.1 Materiales

2.2 Procedimiento de extracción

2.3 Cuantificación y evaluación de calidad

2.4 Preparación del buffer de lisis

3. Aplicaciones downstream

4. Consideraciones adicionales

5. Referencias

Getting Started on McCartney — HPC User Guide

1. Overview

2. Hardware

Partition: basic

Partition: gpu

Which node should I use?

3. Your Account

4. Connecting via SSH

On macOS / Linux

On Windows

5. Transferring Files

Windows — WinSCP (recommended)

macOS / Linux — command line

Faster large transfers — rsync

6. Software Modules

7. The SLURM Job Scheduler

Monitoring commands

8. Writing Job Scripts

Common #SBATCH directives

9. Script Templates

Template A — Single core, low memory

Template B — Multi-core, high memory

Template C — Job array (process multiple samples in parallel)

Template D — Array with local scratch (fast I/O)

10. Using AI to Generate Script Drafts

11. Best Practices

12. Useful Links

13. Getting Help

McCartney SLURM Script Generator

What it does

How to use

DNA Extraction from Sterivex (0.22µm) or Polycarbonate Filter (3µm) (En Español)

1. Extracción de ADN

1.1 Materiales

1.2 Procedimiento

1.3 Preparación del buffer de lisis

Sampling and Filtration of Water from Mesocosm Experiments (En Español)

1. Recolección de muestras de agua

1.1 Materiales

1.2 Procedimiento

2. Filtración de las muestras

2.1 Materiales

2.2 Filtración para determinación de clorofila y nutrientes orgánicos e inorgánicos

2.3 Filtración para extracción de material genético

Capturing microbes with a Coriolis instrument and nucleic acid extraction (En Español)

1. Recolección de muestras de aire.

2. Extracción de ácidos nucleicos.

Sampling the rhizosphere and extracting nucleic acids for viromes and metagenomes (En Español)

1. Recolección de muestras de suelo.

2. Extracción de ácidos nucleicos para metagenomas celulares.

3. Extracción de ácidos nucleicos para metagenomas virales.

Partition: `basic`

Partition: `gpu`

Common `#SBATCH` directives